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CRISPR/Cas9：基因编辑的历史与发展

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CRISPR/Cas系统是细菌和古菌特有的一种天然防御系统，用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。当外源基因入侵时，该防御系统的 CRISPR 序列会表达与入侵基因组序列相识别的 RNA，然后 CRISPR 相关酶(Cas)在序列识别处切割外源基因组DNA，从而达到防御目的。

根据Cas蛋白的特点，可将CRISPR/Cas系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系统需要借助复杂的蛋白复合体发挥作用，Ⅱ型系统仅借助 Cas9蛋白和sgRNA即可对靶目标进行编辑，结构简单，操作容易，因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系统。

CRISPR/Cas自诞生以来，迅速发展，已经成为生命科学领域最耀眼、最有前景的技术。尤其是近两年，在全世界科学家的共同努力下，CRISPR/Cas相关新进展新突破不断涌现。

一、基因编辑技术的发展史

基因编辑可以分为三代，第一代：ZFN；第二代：TELEN；第三代：CRISPR/Cas。这三个基因编辑技术都利用了DNA修复机制，所以我们先来了解一下DNA修复机制（ 图1 ）。[上传失败...(image-8dab49-1625385468208)]

图1-NHEJ修复（左），HDR修复（右）

NHEJ（Non-homologous end joining）

非同源性末端接合

NHEJ修复机制不需要任何模版，修复蛋白直接将双股裂断的DNA末端彼此拉近，在DNA连接酶的帮助下重新接合（ 图1 ）。

HDR（Homology directed repair）

同源重组修复

当细胞核内存在与损伤DNA同源的DNA片段时，HDR才能发生。

NHEJ的机制简单又不依靠模版，因而NHEJ的活性相对于HDR高出许多。但NHEJ修复出错的概率较高，容易造成移码突变等，基因编辑正是利用了这一点（ 图1 ）。

1.ZFN的识别切割机制

融合锌指模块和FokI切割结构域形成ZFN ；以二聚体的形式靶向切割每个锌指结构；特异识别3个碱基 ；组装多个锌指结构(识别12-18bp)形成的ZFN对可特异切割基因组靶点 （ 图2 ）。

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图2-ZFN基因编辑原理图

2.TALEN的识别切割机制

两个TALE靶向识别靶点两侧的序列；每个TALE融合一个FokI内切酶结构域；FokI通过TALE靶向形成二聚体切割靶点；设计灵活识别特异性强（ 图3 ）。

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图3-TELEN基因编辑原理图

3.CRISPR/Cas9的识别切割机制

crRNA通过碱基配对与 tracrRNA结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA（ 图4 ）。

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图4-CRISPR/Cas9基因编辑原理图

ZFN、TELEN、CRISPR/Cas9比较

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图5-三种基因编辑的比较

二、CRISPR/Cas技术的介绍

CRISPR/Cas9 系统的发现

1987年，在大肠杆菌的基因组中首次发现了一个特殊的重复间隔序列——CRISPR序列，随后，在其他细菌和古菌中也发现了这一特殊序列。

2005年，发现这些CRISPR序列和噬菌体的基因序列匹配度很高，说明CRISPR 可能参与了微生物的免疫防御。

2011年，CRISPR/Cas系统的分子机制被揭示：当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR 转录生成 前体crRNA (pre-crRNA)， pre-crRNA 经过加工形成含有与外源基因匹配序列的crRNA，该crRNA与病毒基因组的同源序列识别后，介导 Cas 蛋白结合并切割，从而保护自身免受入侵。

2013年，发现CRISPR/Cas9系统可高效地编辑基因组。随后张锋等使用CRISPR系统成功的在人类细胞和小鼠细胞中实现了基因编辑。

从此开始，CRISPR/Cas9技术给生命科学领域带来了巨大冲击，CRISPR/Cas9相关研究成果频频登上CNS等顶级期刊，近两年更是成为诺贝尔奖热门候选。

CRISPR/Cas技术的原理

CRISPR/Cas9系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA，改造成具有引导作用的sgRNA （single guide RNA ），从而引导 Cas9 对 DNA 的定点切割（图4）。

CRISPR/Cas技术的优势

设计简单，简明的碱基互补设计原则，识别不受基因组甲基化影响，能靶向几乎任意细胞任意序列，方便同时靶向多个靶点，切割效率高。

三、CRISPR/Cas的脱靶效应

PAM**** (Protospacer adjacent motif )

前间区序列邻近基序

PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的基本条件。如果靶序列 3′端没有PAM序列，即使靶序列与sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不会切割该序列位点。 PAM序列主要影响CRISPR/Cas9的DNA切割效率。在细胞水平上，NGG介导的切割效率是最高的。

sgR****NA ****(Single guide RNA )

向导 RNA

sgRNA与目标基因组相结合的 20nt 序列区决定着 CRISPR/Cas 系统的靶向特异性。CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性其实主要依赖于sgRNA与靠近PAM区的10~12 bp的碱基配对，而其余远离PAM序列 8~10 bp 碱基的错配对靶位点识别的影响并不明显。目前研究结果均提示，可能靠近 PAM 的 8~14 bp 序列是决定特异性的关键，其他序列也均在不同程度上影响脱靶效应。

CRISPR/Cas9的脱靶效应给研究带来了一定程度上的不确定性，也是限制其发挥更大潜力的主要原因之一。

2017年5月30日， Nature 杂志子刊 Nature Methods 刊登了美国哥伦比亚大学研究人员的一篇文章，研究人员通过CRISPR/Cas9成功修复了导致小鼠失明的基因后，对小鼠进行全基因测序，发现修复后的小鼠基因组有超过1500个单核苷酸突变，以及超过100个位点发生大片段插入或缺失（ 图6 ）。文章的结论无疑引发了巨大震动，也给正在进行中的CRISPR/Cas9带来了不确定性。

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图6--动物体内实验中CRISPR/Cas9编辑后发生意想不到的突变

仔细分析后，发现该文章并不十分严谨，文章仅有两只小鼠作为实验组，一只作为对照组，数量不足以证明结论是否只是个例。而且单碱基突变是生物体内自然现象，不能全归于CRISPR/Cas9。整个实验只基于一个sgRNA数据，且该sgRNA特异性评分很低，造成脱靶效应也应该在预料之中（ 图7 ）。

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图7--针对 Nature Methods 文章的回应

经过一系列的研究和改进，目前CRISPR系统的脱靶性已经很低，当然，要想达到理想的状态，还有很长的路要走。

四、CRISPR/Cas技术的进展

2016年6月，张锋在 Science 发表文章，发现CRISPR/Cas13a能有切割细菌的特定RNA序列。

2016年9月，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，证实CRISPR/Cas13a可以用于RNA检测。

2017年2月22日，美国纪念斯隆.凯特林癌症中心（MSK）研究人员在 Nature 杂志发文，使用腺相关病毒（AAV）介导，将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于CAR-T疗法。该研究既解决了传统CAR-T疗法的随机整合可能存在的潜在危害，又大大降低了CAR-T细胞发生分化或癌化的风险，赋予了CAR-T技术全新的高效性、稳定性、安全性。

2017年8月2日，Shoukhrat Mitalipov在 Nature 发表长文，使用CRISPR/Cas9技术修正了植入子宫前的人类胚胎中一种和遗传性心脏病有关的变异。该研究证实了通过编辑人类胚胎进行治疗遗传病是安全可行的。值得一提的是，该成果受到了基因编辑领域大牛George Church等人的质疑。

2017年8月11日，杨璐菡等在 Science 发表文章，通过CRISPR/Cas9技术敲除猪基因组中的内源逆转录病毒（PERV）序列，并克隆出多只PERV失活小猪。向最终实现使用猪器官进行人体器官移植的终极目标迈进了一大步。

2017年9月，杂交水稻之父”袁隆平院士宣布使用CRISPR/Cas9技术敲除与镉吸收和积累相关基因的水稻育种成功。该研究从根本上解决了水稻镉污染的问题，将扭转我国部分农作物重金属超标的问题，进而改善部分人群重金属慢性中毒的问题。

2017年10月4日，张锋在 Nature 发表论文证实CRISPR/Cas13a能够在哺乳动物细胞中编辑特定的RNA。CRISPR/Cas13a能够达到RNAi相似的降低基因表达的效率，而且有更强的特异性，且对细胞内天然的转录后调控网络的影响更小。

2017年10月19日，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，设计了高精确性的Cas9变体—HypaCas9。该研究极大地降低了Cas9的脱靶效应，且不降低靶向切割效率。

2017年10月25日，张锋在 Science 发表文章介绍CRISPR新系统--REPAIR，可以高效的进行RNA的单碱基修复。因为不改变DNA序列，所以为通过基因编辑治疗遗传病而又不永久影响基因组提供了新可能。

2017年10月25日，哈佛大学Broad研究所的David Liu实验室在 Nature 发表长文，报道了新型腺嘌呤基因编辑器——ecTadA-dCas9，可以将A·T碱基对转换成G·C碱基对，该技术首次实现了不依赖DNA断裂即可进行基因编辑的技术，即单碱基基因编辑技术。该技术高于其它基因组编辑方法的效率，且几乎没有随机插入、删除或其它突变等不良副作用，因此为今后大范围治疗点突变遗传疾病提供了极大的便利。

五****、展望

近几年CRISPR/Cas基因编辑技术飞速发展，推广应用到了生物、医学、农业以及环境等多个领域，造就了一批批科研奇迹，尤其是在遗传病的治疗、疾病相关基因的筛查与检测、肿瘤治疗以及动植物的改造、病原微生物防治等领域有着巨大的潜力，也将深远地影响整个世界。

特别感谢：BioArt主编给予的帮助和意见以及吉满生物吴晨提供图1-图5的。

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基因编辑治疗艾滋病，除了艾滋病，基因编辑还能治疗哪些疾病？

今年 3 月，Nature刊登斯隆凯特林癌症纪念中心透过 CRISPR/Cas9 建构强效 CAR-T 细胞的研究论文，确认 CRISPR/Cas9 技术能搬运 CAR 基因到 T 细胞基因组之中的特定位点之上。这种精确的方法能越来越强壮地建构出 CAR-T 细胞，让它肿有害的瘤细胞。

要明白，人体之内适用抗原，假如将具有全新的 DNA 或是 RNA 遗传物质的基因搬运到人体受损组织之中，抗体便会这些基因。因此除使用CRISPR 展开基因编辑，科学家们有一个不懈的方向，便是予 DNA 或是 RNA 遗传物质包一个外壳，让它们免受人体抗体的侵害，进而将这些遗传物质逐出特定的人体受损组织或是器官，因而作为这个外壳保护套的是特定病毒。

目前，科学家的研制出一种叫AAV。这是为什么呢，或许赞赏是由于这种病毒有过“毒”之处了。和其它可做遗传物质保护套的病毒相对。这种基因编辑方法目前也于探险之中，由于逆转录病毒的整合具备随机性，假如引发原癌基因的激活引起癌症，那麽它的安全性把受质疑。因此，找寻特异、有效修缮的靶向工具于基因治疗领域之中倍受关注。

不管怎么说，基因编辑技术的发展是医学领域分析的一小突破。和传统基因治疗方法相对，基因编辑技术高于基因组水平之上对于 DNA 序列展开改造，进而修缮基因缺陷或是变化细胞功能，使完全医治白血病、艾滋病与血友病等恶性疾病也能进行治愈。

CRISPR能查出病毒吗？

Mopic/Shutterstock）

这种被称为CRISPR的基因编辑工具正迅速因其通过从DNA中剪断基因突变来治疗疾病的潜力而闻名。

但是CRISPR这样的基因组工具也有其他可能的能力，例如能够筛选出人类是否存在病毒，如登革热和寨卡病毒，除了像帕金森氏症这样的衰弱性疾病，

，我认为公众对CRISPR的认识非常集中在临床上使用基因编辑治疗疾病的想法上。这无疑是一个令人兴奋的可能性，但这只是一小部分，”纽约基因组中心的内维尔·桑贾纳说，他是纽约大学生物学、神经科学和生理学的助理教授。Sanjana告诉Live Science，“科学家们刚刚用CRISPR做了10件令人惊奇的事情”，

“有了CRISPR，我想你会在合成生物学中看到很多应用，”比如病原体的传感器，

是一个以

为核心的自然防御系统，CRISPR是一种自然防御系统，它是在单细胞微生物中进化出来的，用来对抗入侵的病毒。这场战斗是一场全面的战争。科学家估计，地球上每一个细胞中，大约有10种病毒，它们都会通过将DNA插入细胞内的机器来执行无情的自我复制任务。

细菌使用一个武器库来反击，其中包括CRISPR，它是一系列短病毒，由具有独特序列的间隔物分离的重复DNA序列。当细菌感染病毒时使用它。当病毒的基因片段在细菌内部复制时，CRISPR介入，引导细菌对外来物质的防御。

CRISPR中的蛋白质切断入侵者，但也从入侵者那里收集一个短的DNA序列，蛋白质将其作为间隔物插入细菌的CRISPR中。每次病毒入侵并被摧毁，一个新的间隔被添加到CRISPR中。

在某种意义上，CRISPR中的间隔是细菌战场胜利的一个描述，就像枪管里的杀戮痕迹一样。但是间隔物提供了另一个功能。

当一个先前被击败的病毒试图入侵时，细菌会识别它并开始将入侵者切成小块。当细菌自身繁殖时，它会把它的防御系统传递给它的子细胞。

“事实证明，你可以利用这些特性潜在地开发出一种非常敏感的诊断设备”，可以从人类血液中的病毒（如寨卡病毒）中检测出少量分子，生物化学家和CRISPR专家Sam Sternberg说，他是位于加州伯克利的Caribou Biosciences Inc.的技术开发小组负责人，该公司正在推进CRISPR技术的新应用。[5项正在革新生物技术的惊人技术]

这一领域最新的CRISPR进展之一是一种叫做SHERLOCK的工具（它代表特定的高灵敏度酶报告解锁）。2017年4月，由麻省理工学院和哈佛大学博德研究所的生物工程师詹姆斯·柯林斯（James Collins）和CRISPR先驱冯章（Feng Zhang）领导的一个研究小组在《科学》杂志上报告说，他们设计了一种CRISPR分子，用于寻找血清中的寨卡病毒和登革热病毒株，尿液和唾液被切碎。

研究人员将CRISPR分子编程，使其在切碎病毒时释放荧光信号，这样就可以检测到病毒的存在。夏洛克是如此敏感，它能够区分美国的寨卡病毒株和非洲的登革热病毒株，并能区分一种和另一种。

柯林斯和他的团队能够看到病毒的存在，即使在极低的浓度下，在一个单独的测试中，

夏洛克能够检测出两种不同的抗药性肺炎克雷伯菌。[6个超级bug需要注意]

，然后，在2017年6月，中心大学的一个团队

扒一扒基因编辑技术的“真面目”

自2016年5月2日韩春雨作为通讯作者的“基因编辑技术NgAgo”论文发表引起关注、5月底质疑的声音开始出现，韩春雨实验的可重复争议，不仅科学界议论纷纷，在社会层面也引发了相关讨论。那么，基因编辑技术到底是一项怎么样的技术呢？为什么它这样备受瞩目？今天我们就一起去扒一扒基因编辑技术的“真面目”！

基因编辑技术到底是个什么鬼？

首先我们先介绍一下基因编辑的概念。实际上，“基因编辑”这四个字是比较简化的，严格来说我们应该称它为“基因组定点编辑技术”。这里我们要注意两个关键词，一个是“基因组”，它要在细胞核的基因组里面。

另一个是“定点编辑”，因为在细胞核的基因组里面，不同的基因都有不同的位点。如果我们不是说在特定的基因组位点进行编辑的话，实际上和我们现在讨论的这个技术就大相径庭了。因为有很多其他技术可以改变细胞内的DNA组成。比如线粒体基因替代技术。还有一个就是用重组过的特异毒引入外源基因，但是它不能够定点，它是随机放到基因组里面的，这和我们今天要讨论的基因编辑技术都是不一样的。基因编辑技术，也就是“基因组定点编辑技术”，这个技术指的是对特定DNA片段的敲除、加入以及定点突变。

基因编辑技术的历史

实际上，基因编辑技术不是一个新的概念，早在90年代就开始有了。到目前为止，已经经历了三代。

第一代基因编辑技术就是同源重组建立动物基因敲除（knock-out），基因敲入（knock-in）的基因突变模型。顾名思义，基因敲除（knock-out）指的是把原有的动物基因组的某些基因通过一定的技术把它从动物基因组里敲除出去；基因敲入（knock-in）则是在动物基因组某个位点上把原本不存在的基因通过一定的技术把它整合进去。基因敲除（knock-out）和基因敲入（knock-in）是通过DNA同源重组技术来完成的。这是一个非常复杂的技术。如果要做成一个成功的动物基因敲除（knock-out），基因敲入（knock-in）的基因突变模型，大概需要花费2到3年的时间，投入的资金也比较多。另外，这个技术一般来说是用于建立遗传疾病研究的动物模型，很难用于临床或者说大面积应用在农业畜牧业方面。

第二代基因编辑技术是ZFN,TALEN技术。这两个技术的原理都是通过DNA核酸结合蛋白和核酸内切酶结合在一起建立一个系统。因为这些蛋白可以识别一定的核苷酸序列，通过一定设计形成的系统可以对特定的基因进行基因敲除和基因突变。

第三代基因编辑技术就是最近非常火的CRISPR/Cas9 系统。它的原理就是利用核糖体结构来进行基因编辑。CRISPR/Cas9 系统经过一定的设计可以结合到靶基因上，然后对这个靶基因进行敲除、定点突变或者引入新的外源基因，来进行基因编辑。

为什么第三代基因编辑技术备受瞩目？

确切地说，这三代基因编辑技术到目前为止都存在一定的技术局限性。第一个比较明显的局限性就是脱靶效应。那什么是脱靶效应呢？比如原本设计是对某一个DNA靶点进行基因编辑，但是一直找一直找，却没有找到正确的靶点，实际上却跑到这个点组成相似的位点去了，这就出现了脱靶。

第二个我们关注的问题就是编辑效率。任何技术都有一定的编辑效率。第三代基因编辑技术的效率要比第二代基因编辑技术高，这也是我们为什么对这三代基因编辑技术这么感兴趣的原因。

还有一个问题就是基因编辑技术对同一基因可能会造成不同的基因突变类型。不同的基因突变类型混合在一起，会让检测工作变得复杂很多。在这点上，第三代基因编辑技术同样表现不俗，要比这二代基因编辑技术好很多。

总的来说，为什么第三代基因编辑技术这么受大家的关注？主要得益于它以下几个优点：一是它的设计比较简单；二是它的效率比较高；三是它的价格相对便宜些；四是它的应用范围更广泛些，能针对的靶基因是比较多的。

基因编辑技术有什么用?

我们研究基因编辑技术，那基因编辑技术到底可以应用在哪些方面呢？主要有以下这几个方面：第一个就是可以形成不同基因型的动物模型，这从第一代基因编辑技术就开始做了。建立不同基因型的动物模型的意义在于，对遗传性疾病，这些基因和疾病之间的关系，这些模型可以给出一个比较确切的答案。这对研究遗传性疾病具有重大意义，这也是为什么大家从第一代开始就密切关注基因编辑技术的发展了。

第二个主要是应用在动植物育种。不同的物种的同一个基因上，可能会存在不同的SNP。不同的SNP对正常的生理功能影响是不大的，但是却会影响一定的表型。比如水稻是不是就会更高产一些，动物的瘦肉是不是更多一些等等表型。有了基因编辑技术，在育种的过程中，我们就可以对我们最想要的某一个基因进行单点突出，以实现效益的最大化。目前为止，第三代基因编辑技术效率相比于前两代技术来说是最高的。

还有一个就是对遗传疾病的治疗比较有用。目前来说，基因编辑技术主要是用在人源性的细胞上面，临床还没有用到。我们知道，很多遗传疾病都和细胞的突变有关。如果说利用基因编辑技术，我们能够把致病的基因转换成正常的基因的话，那么对家族有遗传病史的人来说，这将是一个福音。

但是现在的基因编辑技术离临床治疗还远。要应用到临床上需要考虑很多问题，比如这个系统的毒性怎么样？它进去以后会不会引起什么免疫反应？因为现在基因编辑技术还存在脱靶效应，如何对我们要编辑的基因进行准确地定位是个大问题。这些都是需要研究清楚才能上临床的。

（作者：胡昕华，中国科学院神经科学研究所博士。感谢中国科学技术大学化学博士，中国科学技术大学合肥微尺度物质科学国家实验室副研究员，科技与战略风云学会会长袁岚峰的推荐，原创作品，转载请注明出自知识就是力量微信公众号）

（来自网络）

编辑：刘伟琼

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